克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體特異性抗體分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

　　一　克隆化方案

　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。

　　1.　有限稀釋法的程序

　?、佟≈苽滹曫B(yǎng)細(xì)胞懸液同融合前準(zhǔn)備

　?、凇￡?yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml

　　③　取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。

　?、堋∨囵B(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200μl／孔。

　?、荨〉?～9天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。

　　注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。

　　2.　軟瓊脂法

　?、佟≤洯傊呐渲?/p>

　　含20％FCS小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640

　　1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

　　0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　?、凇∮蒙鲜?.5％瓊脂液含有飼養(yǎng)細(xì)胞15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　?、邸“?00／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。

　?、堋?ml 0.5％瓊脂液42℃預(yù)熱在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。

　?、荨』靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

　?、蕖?～5天后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。

　?、摺z測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。

　　二　雜交瘤細(xì)胞的凍存

　　及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。

　　雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿。

　　細(xì)胞凍存液:

　　50％小牛血清

　　40％不完全培養(yǎng)液

　　10％　DMSO二甲亞砜

　　凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中?；蚣?xì)胞管降至0℃ 后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。

　　五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　1.　體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為10～60μg／ml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。

　　2.　體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。

　　①　實(shí)體瘤法　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后一般10～20天則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。但采血量有限。

　　②　腹水的制備　常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液體石臘于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。