采用已建立的間接 ELISA 法分別測(cè)定 3F7 和 9C4 各吸收峰的純化產(chǎn)物，并與純化前的腹水、50%飽 和(NH4)2SO4 沉淀和 45%飽 和 (NH4)2SO4 沉淀的蛋白效價(jià)進(jìn)行比較。將純化后腹水中 McAb 進(jìn)行親和常數(shù)的測(cè)定。

      免疫用抗原制備：參考文獻(xiàn)的方法培養(yǎng) A. acidoterrestris (ATCC49025)，重復(fù)洗滌 2 次后，用生理鹽水將該菌的濃度調(diào)整到 109 CFU/mL。

     包被用抗原制備：取部分洗脫好的菌液用超聲波粉碎儀進(jìn)行裂解。以 20 kHz 頻率、150 W 的功率在冰浴中將細(xì)菌細(xì)胞破碎，每 6 s 間隔 4 s，總共時(shí)間為 30 min。裂解后將液體 3 000 r/min 離心 10 min，將上清與沉淀分別用 Eppendorf 管進(jìn)行分裝，存于?20 °C。

       篩選方法采用間接 ELISA，用方陣滴度法確定抗原包被濃度和酶稀釋度?？乖謩e做 1:1 000、 1:2 000、1:4 000 的稀釋；酶標(biāo)分別做 1:20 000、 1:40 000 的稀釋；免疫小鼠多抗血清用樣品稀釋液從 40×起倍比稀釋；HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG，用酶稀釋液分別做 1:20 000、1:40 000 稀釋；設(shè)陰性和空白對(duì)照；以 450 nm 波長(zhǎng)，以空白對(duì)照調(diào)零，讀記各孔光密度值(OD)，凡P/N>2為陽(yáng)性結(jié)果(P/N= 待測(cè)孔 OD 值/陰性對(duì)照孔 OD 值)。

      取 5 只 6?8 周齡體重 18 g 左右雌性的健康 BALB/c 小鼠，免疫前 7 天卡介苗致敏小鼠 (0.1 mL/每只)。每次免疫間隔 3 周，都較前一次免疫劑量加倍，共 3 次。于第 3 次免疫 7 d 后以間接ELISA 法檢測(cè)小鼠抗體效價(jià)，取效價(jià)最高的小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。確定的抗原包被濃度包被酶標(biāo)板，將免疫小鼠全血按照 100×、200×、 400×?51 200×稀釋，即倍比稀釋的方法進(jìn)行間接 ELISA 法檢測(cè)。

      用 ELISA 疊加試驗(yàn)進(jìn)行抗原位點(diǎn)分析(腹水和細(xì)胞上清)，在確定各 McAb 飽和值的基礎(chǔ)上，在最適菌體抗原包被的酶標(biāo)板內(nèi)分別加入一種飽和濃度 McAb1 (100 μL/孔)，37 °C 作用 30 min，洗滌 4 次后加入另一種飽和濃度的 McAb2 (100 μL/孔)，同樣孵育洗滌；加入 1:1 000 稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP (50 μL/孔)，同樣孵育洗滌；加入 TMB 底物溶液(100 μL/孔)顯色 10 min，2 mol/L H2SO4 終止反應(yīng)，測(cè)定 OD450 值，計(jì)算疊加率(AI)。按如下公式計(jì)算：AI=[2×A(1+2)÷(A1+A2)?1]×100%。公式中： A1為 McAb1 的 OD450值；A2為 McAb2 的 OD450值； A(1+2)為 McAb1 疊加 McAb2 的 OD450值。AI >50% 說(shuō)明被測(cè)的兩株單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn)不同；AI<50% 說(shuō)明被測(cè)的兩株單抗抗原結(jié)合位點(diǎn)相同；且 AI 值越大，抗原位點(diǎn)重疊的可能性越小。